western blot 是(shì)對目的蛋白進行檢測的一種(zhǒng)實驗(yàn)方法(fǎ)，大緻(zhì)分爲：蛋白提取(qǔ)、蛋白定量(liàng)、sds-page電泳(yǒng)、轉膜、封閉(bì)、抗原(yuán)-抗體免疫(yì)反應（一抗(kàng)孵育、二抗(kàng)孵育）、蛋白檢測(cè)。具體的(de)步驟和(hé)原理(lǐ)前(qián)面已有介紹，本(běn)次的主(zhǔ)題主(zhǔ)要針對aw系(xì)列(liè)産(chǎn)品的技術(shù)特點進行詳細介紹，主要分爲(wèi)溫控、高通(tōng)量、高(gāo)回收率三大技(jì)術特點(diǎn)。結(jié)合儀(yí)器技術特點(diǎn)便(biàn)于大家對(duì)本産品的應用有更(gèng)深入的了(le)解，這(zhè)一期(qī)我(wǒ)們先介(jiè)紹aw-12産品的(de)溫控技術特點在western blot實(shí)驗中的具體應(yīng)用。

溫(wēn)控(kòng)技術特(tè)點在western blot實驗步驟(zhòu)中的重(zhòng)要性(xìng)主(zhǔ)要體現在抗原(yuán)-抗體免疫反應(yīng)和顯影(yǐng)前的膜(mó)片浸泡（貯存）兩(liǎng)方面。

一 抗原-抗(kàng)體免疫反應

也(yě)就是western blot實(shí)驗(yàn)步驟(zhòu)中的(de)一抗(kàng)孵育(yù)和二抗(kàng)孵育。在(zài)這個步驟中抗(kàng)體的選擇、抗體(tǐ)的稀釋(shì)比例、抗(kàng)體的孵育時間(jiān)以及(jí)溫(wēn)度對實(shí)驗的結(jié)果都是(shì)十分的重(zhòng)要，每(měi)一個環節(jiē)都不(bú)能出(chū)問題，否則(zé)都會(huì)嚴重影響(xiǎng)實驗結果，導緻(zhì)實驗失敗。

抗原-抗體免疫反應(yīng)示意圖

一(yī)抗孵育

一般我們會(huì)首選(xuǎn)與目的蛋(dàn)白特異性(xìng)結合的單克隆抗體(tǐ)（即單(dān)抗），之前大(dà)多都(dōu)傾向(xiàng)于選(xuǎn)擇國外的一些(xiē)品牌，近來(lái)國産(chǎn)抗體(tǐ)也(yě)相繼出(chū)現一些優秀的(de)品牌可(kě)供(gòng)選擇(zé)。然而對于沒有單抗(kàng)的抗體則(zé)會選(xuǎn)擇有實驗(yàn)驗證(zhèng)或有文獻(xiàn)作爲(wèi)參考(kǎo)的多(duō)克隆抗體(tǐ)（即多(duō)抗）。一抗與目的(de)蛋白表面的抗原表(biǎo)位結合，而膜表面的非特(tè)異性位點因爲被封閉過(guò)程中(zhōng)牛奶的蛋(dàn)白質(zhì)所結合，因此與(yǔ)一抗的(de)結(jié)合量很少，結(jié)合的抗(kàng)體也會在一抗(kàng)清洗時被去除。一抗孵育的溫(wēn)度和時(shí)間，最常(cháng)用的(de)有兩種條件：1）4℃搖(yáo)床過夜孵(fū)育，溫度适宜，分(fèn)子運動溫和，一(yī)抗與目标蛋白(bái)結合充(chōng)分；而且低溫（4℃）條件(jiàn)下也可以(yǐ)提高抗體(tǐ)的回收利(lì)用率(lǜ)，節約(yuē)實(shí)驗成本(běn)。2）37℃搖床孵(fū)育(yù)1-2h，但溫度越(yuè)高，分(fèn)子間(jiān)的運動(dòng)能力增強，出現非特異性(xìng)結合的(de)可能(néng)性就越高；同時(shí)孵育時間較短(duǎn)，也可能會導緻(zhì)一抗與(yǔ)目标蛋(dàn)白結合不(bú)充分(fèn)。但對于一(yī)些非常好(hǎo)用的(de)抗體，這個(gè)孵育(yù)條件(jiàn)也是可以的，但是不利于(yú)抗體的回收利用(yòng)，室(shì)溫條件會(huì)大大降低抗(kàng)體的活(huó)性，影響抗體的重複利用。

然而(ér)無論實驗人員選擇(zé)哪一(yī)種一(yī)抗孵(fū)育的時間(jiān)和條(tiáo)件，aw-12都可以(yǐ)滿足要求，aw-12具備(bèi)了低(dī)溫(wēn)貯(zhù)存、低(dī)溫和(hé)室溫孵育(yù)功能(néng)，低溫貯存(cún)功能可以使貯(zhù)存的抗體(tǐ)在實(shí)驗過程中始終保持(chí)在低(dī)溫狀(zhuàng)态，有利于(yú)維持抗體(tǐ)的活性；低(dī)溫(wēn)和室(shì)溫孵育(yù)功能(néng)可根據實(shí)驗人員的具體(tǐ)實驗(yàn)需求進行(háng)選擇，時間和抗體(tǐ)是否回收也(yě)可根據需求自(zì)行設置，操作簡(jiǎn)單且(qiě)十分(fèn)人性(xìng)化，完(wán)全滿足實(shí)驗人員對(duì)抗體(tǐ)孵育(yù)的各(gè)種要(yào)求。

二抗(kàng)孵(fū)育

一抗結(jié)合(hé)之後，就(jiù)是選擇與(yǔ)一抗結合的(de)二(èr)抗，而(ér)二抗蛋白結構(gòu)被hrp（辣根過氧化物酶(méi)）标(biāo)記，可與發光(guāng)底物(wù)相結(jié)合(hé)，該底物(wù)極強(qiáng)的信号輸出使(shǐ)得目的蛋白被(bèi)檢測到，因此得(dé)到顯(xiǎn)影結果。二抗孵育的一般(bān)條件是室(shì)溫1h，爲(wèi)了防(fáng)止二抗孵(fū)育和清(qīng)洗時間(jiān)過久(jiǔ)導(dǎo)緻hrp信号(hào)減弱，因(yīn)此可以(yǐ)選擇在低溫條(tiáo)件下(xià)清洗二抗，aw-12隻需(xū)要(yào)在二抗清洗步(bù)驟中将(jiāng)溫(wēn)度設爲低溫(wēn)即可，也可選擇在室溫條(tiáo)件下(xià)清洗，根據實驗(yàn)需求進行選擇即可。

二 膜(mó)片浸泡（貯存(cún)）

抗(kàng)原-抗(kàng)體免疫反應完(wán)成後，如(rú)果不及(jí)時進(jìn)行顯色曝(pù)光(guāng)，就需要将膜(mó)片浸泡在(zài)清(qīng)洗(xǐ)液（pbst/tbst）中并保存在(zài)低溫環境(jìng)中，保(bǎo)持膜(mó)片上的抗(kàng)體活性和二抗上hrp的信号(hào)。如果是手(shǒu)工操(cāo)作實驗，最(zuì)後膜片浸(jìn)泡時需要(yào)将膜(mó)片(piàn)孵育盒(hé)放到(dào)4℃冰箱中保(bǎo)存，等(děng)待實驗人(rén)員顯(xiǎn)色曝光(guāng)；而使用aw-12進行(háng)實驗時，我(wǒ)們儀器默認的程序(xù)設(shè)置是(shì)在(zài)膜片浸泡(pào)時始終保持在低溫(wēn)狀态，直到(dào)實驗(yàn)人員(yuán)将膜片拿(ná)出顯色曝(pù)光。

抗(kàng)原-抗體免疫反(fǎn)應步驟(zhòu)手工與aw-12對比圖

從(cóng)上述(shù)對比圖也(yě)可以(yǐ)明顯看出使用aw-12來完成(chéng)抗原-抗體免(miǎn)疫反應至(zhì)顯色曝(pù)光(guāng)這一段實驗(yàn)流(liú)程，不(bú)僅可(kě)以大大節約實驗人(rén)員的(de)時間，aw-12的低(dī)溫貯(zhù)存功(gōng)能(néng)和低溫(wēn)、室溫孵(fū)育(yù)功能(néng)更能靈活的(de)滿(mǎn)足實驗的各種需求(qiú)。