細胞培養在實驗完(wán)成後需(xū)要将細胞凍存(cún)存放(fàng)起(qǐ)來，以便以後(hòu)實(shí)驗需要(yào)，可以将凍存的(de)細胞直接(jiē)複蘇(sū)使用。然而爲了(le)使複蘇得(dé)到的(de)細胞狀(zhuàng)态好，可直接用于(yú)實驗(yàn)，細胞在凍存時(shí)的狀态就顯得尤爲重要，一定(dìng)要選擇細胞培養狀态好的時(shí)候将細胞凍存起來，其次是凍(dòng)存細(xì)胞(bāo)的方式(shì)和條(tiáo)件(jiàn)，凍存液(yè)的選擇等對細(xì)胞凍存(cún)都很重(zhòng)要。

下面簡單介(jiè)紹一下細胞凍存方(fāng)面的知識(shí)

一、什(shí)麽(me)是(shì)細胞(bāo)凍存？

細胞(bāo)放在(zài)低溫(wēn)環境，減少(shǎo)細胞代謝(xiè)，以便長期儲存。

二、細(xì)胞凍存(cún)的具體(tǐ)操作步(bù)驟

1、配制(zhì)含10%dmso、90%胎牛血(xuè)清的凍存液(yè)或市面(miàn)上購買的(de)凍存(cún)液(yè)。

2、從培養箱取(qǔ)出細胞培養瓶(píng)（一般選擇(zé)處于(yú)對數期(qī)的(de)細胞(bāo)），轉移(yí)到超(chāo)淨台(tái)。棄去原有培養(yǎng)液，用1-2ml pbs緩沖液洗(xǐ)滌1次（注(zhù)意(yì)從側壁加入(rù)，以免沖(chòng)掉細胞），棄去pbs緩沖液(yè)。

3、向培(péi)養瓶(píng)中加(jiā)入1ml胰酶，消化，将加入(rù)胰酶的細(xì)胞(bāo)培(péi)養瓶(píng)轉移(yí)到倒置顯(xiǎn)微鏡下觀察細(xì)胞消(xiāo)化情況，當(dāng)細胞(bāo)變圓(yuán)且大(dà)量脫(tuō)落(luò)時，轉移到超淨台。

4、加入(rù)2ml完全培養(yǎng)基，終(zhōng)止消化。用(yòng)移液器充(chōng)分緩慢吹打，使細胞能夠完全脫落。然後(hòu)将細胞(bāo)懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心(xīn)管中(zhōng)，1000rpm/min離心(xīn)5分鍾(zhōng)，轉移(yí)進超淨(jìng)台，打開(kāi)蓋子，棄(qì)去(qù)上清。

5、加(jiā)入适量凍存(cún)液，用移液器輕(qīng)輕吹(chuī)打(dǎ)細胞團(tuán)塊，制備(bèi)成(chéng)細胞懸液(yè)，調節(jiē)凍存(cún)液(yè)中細(xì)胞密度(dù)，根據經驗按照(zhào)t25培養瓶一(yī)瓶凍存2-3管，将細胞分(fèn)裝入凍(dòng)存管中(zhōng)，每(měi)管(guǎn)1-1.5 ml。

6、在凍存管(guǎn)上标(biāo)明細胞的名稱，凍存(cún)時間(jiān)及操作者。

7、将裝有細胞的凍存(cún)管放入4℃冰箱30min，後(hòu)-20℃冰箱30min，然後放入(rù)-80℃冰箱中過夜，取(qǔ)出凍存管(guǎn)，移入(rù)液氮容器(qì)内。或(huò)按照凍存液說(shuō)明書操作。

注意事項(xiàng)

1.使用(yòng)dmso前，不需要進行(háng)高壓(yā)滅菌(jun1)，它本身就(jiù)有滅菌(jun1)的作用(yòng)。高壓(yā)滅(miè)菌反而會破壞它的分(fèn)子結(jié)構，以至于(yú)降低冷凍(dòng)保護效果(guǒ)。在常溫下(xià)，dmso對人體有害(hài)，故在配制時(shí)最好戴上(shàng)手(shǒu)套(tào)操作(zuò)。

2.細胞凍存注意(yì)要慢(màn)凍，按照溫度梯度降溫法(fǎ)進行，不宜将凍存細胞(bāo)放置在(zài)0℃～-60℃這一溫度(dù)範圍(wéi)内過久(jiǔ)，低溫損(sǔn)傷主(zhǔ)要(yào)發(fā)生在(zài)這一溫(wēn)度區内，是“危險溫區”，實驗操作中(zhōng)可将(jiāng)細胞凍存(cún)管裝(zhuāng)在程序降溫(wēn)盒(hé)中再放(fàng)入-80℃冰箱，使之以(yǐ)約(yuē)1℃/min的降(jiàng)溫速度渡過“危(wēi)險溫(wēn)區(qū)”後保留(liú)在低溫(wēn)冰箱或(huò)轉移(yí)至液氮罐(guàn)。

3.注意定期(qī)檢查液氮(dàn)罐内液氮(dàn)量，及時添(tiān)加。